1. 如何開發(fā)高選擇性去泛素化酶（DUB）化學(xué)探針？

去泛素化酶（DUBs）在細(xì)胞內(nèi)負(fù)責(zé)移除蛋白質(zhì)上的泛素修飾，在病毒感染、神經(jīng)退行性疾病及癌癥等多種病理過程中發(fā)揮關(guān)鍵作用，是具潛力的治療靶點(diǎn)。人類基因組編碼約100種DUB，然而目前缺乏能夠特異性識(shí)別并表征其活性的化學(xué)工具，限制了在生理與病理?xiàng)l件下對(duì)其功能的研究。盡管商品化的廣譜熒光底物（如C端泛素序列或熒光標(biāo)記泛素分子）已廣泛應(yīng)用于DUB的生化分析，但仍亟需開發(fā)能夠針對(duì)單個(gè)DUB的高選擇性探針。

2. 如何利用非天然氨基酸篩選DUB的底物偏好？

來自波蘭弗羅茨瓦夫理工大學(xué)的Marcin Drag教授和Wioletta Rut教授團(tuán)隊(duì)在Chemical Science上發(fā)表了一項(xiàng)研究，致力于構(gòu)建基于泛素（Ub）支架的高選擇性DUB化學(xué)探針。該策略的核心是將非天然氨基酸引入保守的C端Ub序列，以系統(tǒng)篩選DUB的底物識(shí)別偏好。

研究以兩種重要的癌癥相關(guān)DUB——MERS PLpro和UCH-L3為模型，構(gòu)建了兩類化學(xué)底物文庫：一類用于篩選P2位點(diǎn)偏好（Ac-Leu-Arg-P2-Gly-ACC），另一類為混合底物文庫，用于評(píng)估P3和P4位點(diǎn)的特異性。篩選結(jié)果顯示，MERS PLpro在P2位點(diǎn)偏好甘氨酸，而UCH-L3更傾向脂肪族氨基酸；在P3位點(diǎn)，UCH-L3強(qiáng)烈偏好精氨酸，MERS PLpro則更接受疏水性殘基?；谶@些特異性圖譜，作者合成了相應(yīng)底物，并經(jīng)由動(dòng)力學(xué)實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證了其高選擇性。

3. 能否構(gòu)建具有選擇性的泛素基不可逆探針？

在明確底物特異性的基礎(chǔ)上，作者進(jìn)一步設(shè)計(jì)了基于Ub的活性探針。這些探針在N端引入檢測(cè)標(biāo)簽（如生物素），C端則嫁接不可逆親電基團(tuán)——乙烯基甲基酯（VME），該集團(tuán)可廣泛與DUB活性位點(diǎn)共價(jià)結(jié)合。

酶動(dòng)力學(xué)分析表明，所構(gòu)建的B-Ub-UCHL3-2-VME和B-Ub-MERS27-VME分別對(duì)UCH-L3和MERS PLpro表現(xiàn)出高效和特異性標(biāo)記能力，其效果優(yōu)于野生型Ub-ACC底物。后續(xù)在細(xì)胞裂解液中的實(shí)驗(yàn)進(jìn)一步證實(shí)了這些探針具有良好的選擇性和細(xì)胞活性。

4. 該策略是否為DUB研究提供通用化工具開發(fā)平臺(tái)？

本研究通過將非天然氨基酸嵌入泛素分子框架，成功開發(fā)出一套活性與選擇性兼具的DUB化學(xué)探針構(gòu)建策略。該方法不僅適用于UCH-L3和MERS PLpro，更具潛力推廣至其他DUB及泛素類似特異性蛋白酶的研究中，為探索DUB在疾病中的作用機(jī)制及開發(fā)靶向療法提供了強(qiáng)有力的化學(xué)工具。