1. 如何通過(guò)生物正交化學(xué)實(shí)現(xiàn)PROTAC前藥的精準(zhǔn)靶向激活？

蛋白質(zhì)降解技術(shù)（PROTAC）借助細(xì)胞內(nèi)天然的泛素-蛋白酶體系統(tǒng)，實(shí)現(xiàn)目標(biāo)蛋白的特異性降解，已成為新藥研發(fā)領(lǐng)域的重要策略。然而，傳統(tǒng)PROTAC分子在體內(nèi)應(yīng)用中仍面臨脫靶毒性、組織非特異性分布以及由過(guò)度活化引起的非預(yù)期蛋白降解等問(wèn)題，嚴(yán)重限制其臨床轉(zhuǎn)化潛力。

針對(duì)上述挑戰(zhàn)，發(fā)表于《Journal of the American Chemical Society》的一項(xiàng)研究提出了一種新型“生物正交前藥"策略。該研究設(shè)計(jì)了一類基于逆電子需求狄爾斯-阿爾德（IEDDA）反應(yīng)的“點(diǎn)擊釋放型PROTAC前藥"（crPROTAC）。IEDDA反應(yīng)因其優(yōu)異的生物相容性、高速率常數(shù)和高正交性，特別適用于復(fù)雜生物環(huán)境中的靶向激活。

具體而言，研究團(tuán)隊(duì)合成了兩種惰性前藥形式：TCO-ARV-771 和 TCO-DT2216。它們通過(guò)在PROTAC分子上引入反式環(huán)辛烯（TCO）保護(hù)基團(tuán)，阻斷其與E3泛素連接酶及目標(biāo)蛋白的正常結(jié)合，從而避免在非靶區(qū)域激活。當(dāng)前藥與帶有疊氮苯并環(huán)辛炔（Tz）修飾的靶向配體——例如常用于腫瘤靶向的c(RGDyK)肽——相遇時(shí)，TCO與Tz發(fā)生IEDDA反應(yīng)，原位釋放出具有活性的PROTAC分子，實(shí)現(xiàn)精準(zhǔn)的靶點(diǎn)激活和蛋白降解。

該策略不僅在細(xì)胞模型中顯著降低了脫靶降解，還提高了PROTAC在異種移植瘤模型中的抗腫瘤效果與安全性，為開(kāi)發(fā)基于生物標(biāo)志物響應(yīng)型的下一代PROTAC前藥提供了堅(jiān)實(shí)理論基礎(chǔ)和技術(shù)路徑。

2. 如何實(shí)時(shí)監(jiān)測(cè)E3連接酶活性并推進(jìn)高通量藥物篩選？

E3泛素連接酶在調(diào)控蛋白質(zhì)穩(wěn)定性、信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)及細(xì)胞進(jìn)程等方面發(fā)揮核心作用，其功能異常與腫瘤、神經(jīng)退行性疾病等多種病理狀態(tài)密切相關(guān)。然而，由于缺乏實(shí)時(shí)、高效的酶活監(jiān)測(cè)工具，E3連接酶的研究及其抑制劑開(kāi)發(fā)一直面臨較大困難。

近期，《Angewandte Chemie International Edition》報(bào)道了一種開(kāi)創(chuàng)性的遺傳編碼型前熒光探針——UbSRhodol，可用于實(shí)時(shí)、定量檢測(cè)依賴于半胱氨酸的E3連接酶活性。該探針巧妙地將泛素（Ub）的C端通過(guò)氨基甲酸酯鍵連接至掩蔽狀態(tài)的羅丹明熒光團(tuán)，形成硫酯中間體模擬物。在自然狀態(tài)下，羅丹明以內(nèi)酯形式存在，幾乎無(wú)熒光；而當(dāng)E3連接酶催化半胱氨酸攻擊該硫酯鍵時(shí)，會(huì)發(fā)生轉(zhuǎn)硫酯化反應(yīng)，生成E3~Ub共價(jià)復(fù)合物，并同時(shí)釋放出游離的羅丹明，恢復(fù)強(qiáng)烈熒光信號(hào)。

研究者驗(yàn)證了UbSRhodol在多種E3酶（如Ube2T、Parkin等）活性檢測(cè)中的適用性，并展示了其應(yīng)用于高通量抑制劑篩選平臺(tái)的潛力。不僅如此，該探針還可用于監(jiān)測(cè)蛋白質(zhì)-蛋白質(zhì)相互作用引起的構(gòu)象變化及酶動(dòng)力學(xué)過(guò)程，為理解泛素信號(hào)網(wǎng)絡(luò)的動(dòng)態(tài)調(diào)控提供了新型化學(xué)工具。

這一技術(shù)不僅推動(dòng)E3連接酶功能研究的深度和廣度，也為針對(duì)E3的藥物發(fā)現(xiàn)和化學(xué)生物學(xué)研究提供了強(qiáng)有力的手段。