L-乳酸被認(rèn)為是信號(hào)傳導(dǎo)和代謝平衡的關(guān)鍵分子。乳?；环N由L-乳酸衍生的蛋白質(zhì)翻譯后修飾（PTM），在多種蛋白質(zhì)上普遍存在，并在細(xì)胞過程中發(fā)揮重要作用。25年6月由浙江大學(xué)張龍教授團(tuán)隊(duì)發(fā)表在《STAR Protocol》上的《Protocol for label-free quantitative lysine lactylproteome profiling》介紹了一種全面分析乳酰化蛋白質(zhì)組并進(jìn)行無標(biāo)簽定量的方法。作者詳細(xì)介紹了細(xì)胞制備、蛋白質(zhì)提取、消化、肽脫鹽及乳酰肽富集的步驟。此外，還概述了液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜（LC-MS/MS）分析的參數(shù)設(shè)置。

方案概覽：

準(zhǔn)備工作：

該方案描述了在AARS1和AARS2（AARS1/2）敲低、過表達(dá)以及野生型細(xì)胞中進(jìn)行乳酸化分析的定量方法。

實(shí)驗(yàn)時(shí)需準(zhǔn)備以下材料：

1. 編碼AARS1/2的哺乳動(dòng)物細(xì)胞表達(dá)載體及針對(duì)AARS1/2的siRNA

2. 在含有10%（體積比）胎牛血清、100 mg/mL青霉素和鏈霉素的DMEM培養(yǎng)基中培養(yǎng)HEK293T細(xì)胞和HeLa細(xì)胞

3. 將細(xì)胞系置于37C、5%二氧化碳的濕潤培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。定期檢測(cè)是否有支原體細(xì)胞污染

4. 至少每48小時(shí)更換一次細(xì)胞培養(yǎng)基，吸出一半舊培養(yǎng)基（注意不要破壞細(xì)胞spheroids結(jié)構(gòu)），并補(bǔ)充等量的新鮮培養(yǎng)基

5. 校準(zhǔn)LC-MS設(shè)備，并運(yùn)行質(zhì)量控制樣本，如HeLa細(xì)胞裂解物標(biāo)準(zhǔn)品，以確保LC-MS/MS性能符合預(yù)期

分步方法詳解

• 細(xì)胞培養(yǎng)

時(shí)間：2天

本部分介紹了用于轉(zhuǎn)染的 HEK293T 細(xì)胞培養(yǎng)物的制備

• 37℃水浴中預(yù)熱 DMEM、PBS 和胰蛋白酶-EDT

• 使用10 cm 培養(yǎng)皿培養(yǎng) HEK293T 細(xì)胞，在培養(yǎng)條件為5% CO2和 37℃，使用DMEM 培養(yǎng)基培養(yǎng)直至達(dá)到 80%–90% 細(xì)胞密度

• 吸出生長培養(yǎng)基并用 2 mL 無菌 PBS 輕輕清洗細(xì)胞兩次

• 吸出 PBS，加入 1 mL 胰蛋白酶-EDTA 分離細(xì)胞，37℃孵育直至細(xì)胞分離（約 30 秒

• 為了中和胰蛋白酶-EDTA，添加 2 mL 生長培養(yǎng)基并通過移液重新懸浮，直到所有細(xì)胞從培養(yǎng)皿底部剝離

• 將細(xì)胞懸浮液轉(zhuǎn)移到 15 mL Falcon 管中，在 22℃–25℃之間以 200 xg 離心 3 分鐘，使細(xì)胞沉淀

• 吸出上清液并將細(xì)胞沉淀物重懸在 1 mL 新鮮生長培養(yǎng)基中

• 將四分之一的細(xì)胞懸浮液接種到一個(gè)新的 10 厘米培養(yǎng)皿中，并添加額外的8 毫升新鮮生長培養(yǎng)基

• 培養(yǎng)細(xì)胞直至其達(dá)到轉(zhuǎn)染所需的最佳細(xì)胞密度

• 細(xì)胞轉(zhuǎn)染

時(shí)間：60-120分鐘

將AARS1/2 siRNA、AARS1/2質(zhì)?；?qū)φ召|(zhì)粒單獨(dú)或組合轉(zhuǎn)染至HEK293T細(xì)胞中。每次處理應(yīng)至少準(zhǔn)備兩個(gè)10 cm細(xì)胞培養(yǎng)皿，以提供足夠的蛋白質(zhì)用于乳酰肽的富集。在本方案中，我們使用聚乙烯亞胺(PEI)轉(zhuǎn)染AARS1/2構(gòu)建體或?qū)φ召|(zhì)粒，并使用脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染siRNA。轉(zhuǎn)染所需的siRNA、DNA構(gòu)建體和轉(zhuǎn)染試劑用量見下面。

10、轉(zhuǎn)染前培養(yǎng)細(xì)胞直至其達(dá)到 40%–50% 細(xì)胞密度

11、使用不含血清的 DMEM 培養(yǎng)基稀釋表中所示適量的 siRNA 或質(zhì)粒

注意：siRNA 應(yīng)懸浮于無 RNase 的水中，并以 20–100 mM 的濃度儲(chǔ)存

• 使用無血清的 DMEM 培養(yǎng)基，按照表中所示稀釋適量的脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染試劑或PEI，將其與稀釋的 siRNA 或質(zhì)?；旌?，室溫孵育 20 分鐘

• 將DNA混合物逐滴加入相應(yīng)的培養(yǎng)皿中

• 將轉(zhuǎn)染后的細(xì)胞置于37℃、5%二氧化碳的培養(yǎng)箱中孵育6小時(shí)

• 吸出培養(yǎng)基，更換為新鮮的DMEM培養(yǎng)基

注意：在所有siRNA實(shí)驗(yàn)中，必須設(shè)置對(duì)照組以評(píng)估靶向基因敲低的效果

• 乳酸刺激

時(shí)間：1天

為了更全面地比較不同實(shí)驗(yàn)中蛋白質(zhì)乳酸化水平的變化，除了常規(guī)培養(yǎng)的細(xì)胞外，我們還建立了一個(gè)平行組，在該組中，乳酸被添加到細(xì)胞培養(yǎng)基中，以提高乳酸化的水平。

16. 更換為新鮮的DMEM培養(yǎng)基后，將乳酸溶液以25 mM的最終濃度加入培養(yǎng)基中

17. 在培養(yǎng)箱中繼續(xù)孵育細(xì)胞24-36小時(shí)

• 細(xì)胞收獲和裂解

耗時(shí)：2小時(shí)

18. 小心地從細(xì)胞中吸出培養(yǎng)基

19. 每次添加 2 mL 冰冷 PBS 沖洗細(xì)胞兩次

20. 加入 1 mL PBS 并吹打直至所有細(xì)胞脫離培養(yǎng)皿底部，從而分離細(xì)胞。將細(xì)胞收集到新的 1.5 mL Eppendorf 管中

注意：如果細(xì)胞粘附過度，無法通過移液器將其從培養(yǎng)皿底部取下，請(qǐng)使用細(xì)胞刮刀將細(xì)胞分離

21. 在 4℃ ，900 x g 離心 10 分鐘，沉淀細(xì)胞

22. 吸出上清液。

注意：如果您計(jì)劃進(jìn)行 SILAC 實(shí)驗(yàn)，請(qǐng)?jiān)诖瞬襟E中計(jì)數(shù)細(xì)胞并混合等量的重同位素標(biāo)記細(xì)胞和對(duì)照細(xì)胞

23. 用 500 mL denaturing lysis buffer重懸細(xì)胞沉淀

24. 使用ultrasonic Horn進(jìn)行超聲處理以降低細(xì)胞裂解物粘度（共 2 分鐘；脈沖模式：開啟 2 秒，關(guān)閉 2 秒；幅度設(shè)置為 35%）

注意：

• 應(yīng)根據(jù)蛋白質(zhì)的量和蛋白質(zhì)溶液的體積來選擇超聲的尺寸和超聲波處理的持續(xù)時(shí)間

• 使用冰浴以防止超聲處理過程中蛋白質(zhì)降解

25. 將樣品在 4°C 下以 13000 x g 的速度離心 15 分鐘，以去除不溶性物質(zhì)。將上清液收集到一個(gè)新的 1.5 mL Eppendorf 管中

• 蛋白質(zhì)消化

耗時(shí)：0.5天

26. 使用 BCA 分析法確定細(xì)胞裂解物的蛋白質(zhì)濃度，并分離 2 mg 蛋白質(zhì)進(jìn)行消化

注意：BCA 檢測(cè)的標(biāo)準(zhǔn)曲線應(yīng)覆蓋樣品預(yù)期濃度的整個(gè)范圍。每次檢測(cè)樣品都需要建立標(biāo)準(zhǔn)曲線

27.沉淀蛋白質(zhì)

A、用 100 mM Tris-HCl、pH 8.5 將裂解物溶液稀釋至 4 M 尿素

關(guān)鍵：濃度為 8 M 時(shí)，添加丙酮后尿素會(huì)沉淀出來，影響蛋白質(zhì)的消化效率

B、將冰冷的丙酮添加到裂解物溶液中，并在 -20℃ 下孵育混合物 30 分鐘，使用體積為裂解物溶液六倍

C、在 4℃ 下以 13000 x g 離心 30 分鐘，使沉淀的蛋白質(zhì)沉淀下來。

暫停點(diǎn)：樣品可以在-80℃的溫度下在此點(diǎn)保存長達(dá)1個(gè)月

28.用 Lys-C 消化

A、用 500 μL 50 mM ABC 緩沖液重新懸浮蛋白質(zhì)沉淀

注意：50 mM ABC 緩沖液的 pH 應(yīng)為 8.0。如果 pH 值偏差過大，請(qǐng)準(zhǔn)備新的緩沖液

B、將 Lys-C 添加到裂解物中，最終濃度為 10 ng/μL

C、 37℃ 下孵育 3-4 小時(shí)。

關(guān)鍵：將蛋白質(zhì)顆粒懸浮在轉(zhuǎn)速設(shè)為 1500 rpm 的培養(yǎng)搖床上

29.用胰蛋白酶消化

A、以 1:100 的酶與底物比例將胰蛋白酶添加到反應(yīng)混合物中

B、在 37℃ 下孵育 12 小時(shí)

30.肽還原和烷基化

A、將 5 μL  1 M TCEP 緩沖液加入蛋白消化液中，充分混勻，25℃ 孵育 15 分鐘

B、將 10 μL  500 mM IAA 緩沖液加入蛋白消化液中?；靹颍?5℃避光孵育 20 分鐘

關(guān)鍵：IAA 對(duì)光不穩(wěn)定，烷基化應(yīng)在黑暗中進(jìn)行。

31. 通過添加 TFA 至最終濃度為 1% 來終止消化

32. 在室溫下以 13000 x g 的速度離心樣品 5 分鐘，以去除不溶性物質(zhì)

33. 將上清液轉(zhuǎn)移到新的 5 mL Eppendorf 管中進(jìn)行肽脫鹽

• 肽脫鹽

耗時(shí)：0.5天

文中使用reverse-phase Strata-X 33 mm Polymeric sorbent solid-phase extraction cartridges 柱體尺寸的選擇應(yīng)基于消化蛋白的量，約為填料重量的 10% (wt/wt)。

34.用 1 mL 脫鹽活化緩沖液cartridges

關(guān)鍵：洗脫步驟前請(qǐng)勿排空濾芯。每個(gè)步驟結(jié)束時(shí)，濾芯上方應(yīng)保留一層液體。

35.使用 2 mL SPE 平衡緩沖液平衡cartridges

36.裝入收集的肽溶液。

注意：樣品通過后，catridges可能會(huì)變黃，這表明已經(jīng)進(jìn)行了還原和烷基化。

37.用 2 mL SPE 平衡緩沖液清洗。

38.用 1 mL SPE 洗脫緩沖液洗脫，并將洗脫液收集到新的 1.5 mL Eppendorf 管中

39.分離 50 μL  洗脫液（100 μg 細(xì)胞裂解液肽）并用離心機(jī)干燥

注意：分離的肽將用于蛋白質(zhì)組分析

40.用液氮冷凍洗脫液，然后將其凍干

關(guān)鍵：

• 凍干，并去除樣品中的所有殘留酸，以便進(jìn)行下一步的乳肽富集步驟

• 凍干粉應(yīng)呈黃白色蓬松狀。如果無法凍干，請(qǐng)使用 SpeedVac 離心機(jī)干燥洗脫液

暫停點(diǎn)：樣品可以在-80℃的溫度下在此點(diǎn)保存長達(dá)1個(gè)月

• 乳酸化肽段富集

耗時(shí)：0.25天

使用抗L-乳酰賴氨酸抗體偶聯(lián)瓊脂糖珠（可使用斯達(dá)特Anti-L-lactyllysine?agarose?Beads替代，貨號(hào)：S0F0003，用量可根據(jù)說明書及樣本情況進(jìn)行調(diào)節(jié)）。珠子的用量應(yīng)根據(jù)消化的蛋白質(zhì)量確定。在本方案中，每2 mg蛋白質(zhì)消化物建議使用10 μL抗L-乳酰賴氨酸抗體偶聯(lián)瓊脂糖珠（圖1）。在每個(gè)步驟中，使用微量離心機(jī)在4℃下以1000 x g離心1分鐘，使珠子沉淀

圖 1 利用 Anti-L-lactyllysine?agarose?Beads富集乳酰肽的示意圖

注意：在正式實(shí)驗(yàn)前，研究人員應(yīng)應(yīng)用HeLa細(xì)胞裂解物等標(biāo)準(zhǔn)品進(jìn)行預(yù)實(shí)驗(yàn)，確?？筁-乳酰賴氨酸抗體偶聯(lián)瓊脂糖珠的富集效率在不同批次和供應(yīng)商之間保持一致

41.將凍干肽重懸于1 mL乳酰肽binding buffer中。渦旋或超聲處理是確保肽溶解的必要措施

注意：在肽富集之前檢查溶液的pH值。pH值應(yīng)約為8.0

42. 在 4℃ 下以 13000 x g 離心 10 分鐘，使溶液澄清

43. 吸取10 μL Anti-L-lactyllysine?agarose?Beads，用1 mL乳酰肽binding buffer清洗微珠。離心使微珠沉淀

44. 將澄清的肽溶液轉(zhuǎn)移到含有Anti-L-lactyllysine?agarose?Beads的管中，并在 4℃ 下旋轉(zhuǎn)孵育 4 小時(shí)

注意：為確保乳酸化肽的富集效率，孵育時(shí)間應(yīng)不少于4小時(shí)。不建議過夜孵育，因?yàn)檫^夜孵育會(huì)導(dǎo)致更多的非特異性結(jié)合

45.通過離心將Beads沉淀下來

注意：收集上清液作為備用，以防乳肽富集失敗。上清液可在-80℃保存長達(dá)1個(gè)月

46.用 1 mL lactylpeptide binding buffer在 4℃ 下旋轉(zhuǎn)清洗珠子兩次，每次 10 分鐘

47.用 1 mL lactylpeptide wash buffer 4℃下旋轉(zhuǎn)洗滌珠子兩次，每次 10 分鐘

48.在 4℃ 下旋轉(zhuǎn)，用 1 mL 50 mM  ammonium bicarbonate buffer進(jìn)行最后清洗 10 分鐘

49.從珠子中洗脫乳酸化肽段

• 用 100 μL  1% TFA 重懸珠子，室溫放置 10 分鐘。離心使珠子沉淀，將上清液收集到新的 1.5 mL Eppendorf 管中

• 用 50 μL  1% TFA 重懸珠子，旋轉(zhuǎn)孵育 10 分鐘。離心使珠子沉淀，將上清液與第一次洗脫液合并。

注意：可使用 0.22 mm 過濾器過濾溶液以去除殘留珠子

• Stage-tip 脫鹽

時(shí)間：2 小時(shí)

乳酰肽洗脫液需要使用 C18 Stage-tip 進(jìn)行凈化，以進(jìn)行質(zhì)譜分析。在本方案中，我們采用 Empore C18 固相萃取盤 (2215-C18) 來進(jìn)行Stage-tip。

注意：應(yīng)根據(jù)您的階段吸頭調(diào)整離心速度，并確保溶劑流速保持在 5 μL /min

50. 用 20 μL 脫鹽活化緩沖液調(diào)節(jié)Stage-tip

51. 用 20 μL Stage-tip脫鹽緩沖液 B 清洗階段吸頭

52. 用 20 μL Stage-tip脫鹽緩沖液 A 平衡階段吸頭

53. 使乳酸化肽洗脫液通過Stage-tip

54. 用 20 μL Stage tip 脫鹽緩沖液 A 對(duì)樣品進(jìn)行脫鹽

55. 將 Stage-tip 轉(zhuǎn)移至新的 Eppendorf 管中

56. 用 20 μL Stage-tip 脫鹽緩沖液 C 洗脫肽。收集流穿液

57. 用 20 μL Stage-tip 脫鹽緩沖液 B 洗脫肽。將流穿液與第一次洗脫的流穿液合并

58. 在 SpeedVac 離心機(jī)中干燥洗脫液

暫停點(diǎn)：此時(shí)樣品可在 -80℃ 下保存長達(dá) 1 周

• LC-MS 分析

時(shí)間：數(shù)周

作者描述了 Orbitrap Exploris 480 與 Easy-nLC 1200 系統(tǒng)的聯(lián)用設(shè)置

59.準(zhǔn)備 LC-MS/MS 設(shè)備

A、安裝足量的新鮮流動(dòng)相溶劑 A 和溶劑 B。需要對(duì)溶劑 A 和 B 進(jìn)行超聲處理以清除氣泡

B、用流動(dòng)相緩沖液沖洗泵 A、泵 B 和泵 S 中的空氣。沖洗閾值為 10 μL

C、用 10 μL 的 90% 溶劑 B 緩沖液激活分析柱

D、通過運(yùn)行空白樣品平衡分析柱。確保流動(dòng)相流路順暢

注意：安裝流動(dòng)相溶劑、沖洗空氣和激活分析柱可能需要 1小時(shí)。運(yùn)行空白樣品可能需要 30 分鐘

60.制備 Klac 富集樣品

A、將富集的 Klac 肽溶解于 5 μL  0.1% 甲酸（溶劑 A）中

B、 4oC 下以 12,000x g 離心 20 分鐘以去除不溶性物質(zhì)。

C、將 4.5 μL  上清液轉(zhuǎn)移到自動(dòng)進(jìn)樣器小瓶中

D、將 4 μL  樣品裝入 Easy-nLC 1200 HPLC

61. 制備蛋白質(zhì)組樣品。

A、用 20 μL  0.1% 甲酸（溶劑 A）溶解步驟 39 中分離的肽

B、在 4oC 下以 12,000x g 離心 20 分鐘以去除不溶性物質(zhì)

C、將 18 μL  上清液轉(zhuǎn)移到自動(dòng)進(jìn)樣器小瓶中

D、將 1 μL  樣品裝入 Easy-nLC 1200 HPLC 中

62. LC 梯度設(shè)置如下圖所示

63、MS 參數(shù)

使用以下參數(shù)設(shè)置 Orbitrap Exploris 480 的質(zhì)譜方法

A、正離子模式

B、噴霧電壓為 2.0 kV

注意：如果Steel emitter有污漬或磨損，導(dǎo)致噴霧不穩(wěn)定，請(qǐng)將噴霧電壓增加到 2.1 kV

• 加熱毛細(xì)管溫度為 320oC

• 將全 MS 分辨率設(shè)置為 60,000，最大注射時(shí)間為 25ms

• 將 MS1 質(zhì)量范圍設(shè)置為 350–1400，AGC 目標(biāo)設(shè)置為 1e6

• 使用 Top20 方法將 HCD 碎片譜圖分辨率設(shè)置為 15,000，最大進(jìn)樣時(shí)間為 22 毫秒

• 將 MS2 質(zhì)量范圍設(shè)置為 200–1400 m/z，AGC 目標(biāo)設(shè)置為 5e4

• 將最大進(jìn)樣時(shí)間為 45 ms

• 將隔離窗口設(shè)置為 6 m/z，標(biāo)準(zhǔn)化碰撞能量設(shè)置為 27%。

• 數(shù)據(jù)處理

時(shí)間：0.5 天

概述了使用 MaxQuant 處理原始文件的方法。我們提供了設(shè)置新修改的詳細(xì)步驟以及無標(biāo)記定量的參數(shù)。在本方案中，作者使用 MaxQuant（版本 2.0.3.0），并在 UniProtKB 人類完整蛋白質(zhì)組序列數(shù)據(jù)庫中搜索所有獲取的原始文件。請(qǐng)參閱圖 2，了解 MaxQuant 用于分析這些數(shù)據(jù)的詳細(xì)參數(shù)工作流程。其他軟件，例如 Proteome Discoverer、pQuant 和 MSFragger，也可用于處理質(zhì)譜原始文件和進(jìn)行非標(biāo)記定量分析。

注意：賴氨酸的乳酸化會(huì)阻止胰蛋白酶消化賴氨酸 C 端。因此，我們建議在“乳酸化 (K)"中選擇“非 C 端"。

圖 2 配置 MaxQuant 參數(shù)以鑒定和定量乳酰肽

• 預(yù)期結(jié)果

在本方案中，作者執(zhí)行了一個(gè)工作流程來高效富集乳酰賴氨酸肽?；谫|(zhì)譜分析，可以全面分析乳酰賴氨酸修飾，并量化對(duì)照細(xì)胞、AARS1/2 敲低細(xì)胞和 AARS1/2 過表達(dá)細(xì)胞中的修飾水平。下表顯示了使用本方案中描述的工作流程在指定細(xì)胞中鑒定出的乳酰賴氨酸修飾位點(diǎn)數(shù)量。此外，圖 3 和圖 4 展示了熱圖，描繪了各組乳酰賴氨酸修飾的差異。

圖 3 熱圖顯示對(duì)照、AARS1 和/或 AARS2 耗盡 (si-AARS1/si-AARS2) HEK293T 細(xì)胞中整體賴氨酸乳酸組的顏色編碼強(qiáng)度水平，用 PBS (Lac ''-'') 或 L-乳酸 (Lac ''+'') 處理 24 小時(shí)

圖 4. 熱圖顯示了在用對(duì)照（AARS1-/AARS2 -）或 AARS1/AARS2 表達(dá)質(zhì)粒（AARS1 +/ AARS2 +）轉(zhuǎn)染的 HeLa 細(xì)胞中，整體賴氨酸乳?；念伾幋a強(qiáng)度水平

斯達(dá)特乳酸化相關(guān)抗體

杭州斯達(dá)特 志在為全球生命科學(xué)行業(yè)提供優(yōu)質(zhì)的抗體、蛋白、試劑盒等產(chǎn)品及研發(fā)服務(wù)。依托多個(gè)開發(fā)平臺(tái)：重組兔單抗、重組鼠單抗、快速鼠單抗、重組蛋白開發(fā)平臺(tái)（E.coli,CHO,HEK293,InsectCells）,已正式通過歐盟98/79/EC認(rèn)證、ISO9001認(rèn)證、ISO13485。

Cell Star Protocol 重磅解析： 無標(biāo)簽定量賴氨酸乳酸化蛋白組分析方案