T細(xì)胞來源確認(rèn)：
外周血單個核細(xì)胞（PBMC）需新鮮分離（采血后6小時內(nèi)處理），活細(xì)胞率≥95%；
冷凍保存的T細(xì)胞復(fù)蘇后，需經(jīng)流式細(xì)胞術(shù)檢測CD3+細(xì)胞比例（目標(biāo)值≥85%）。
無菌操作規(guī)范：
實驗全程在生物安全柜內(nèi)進(jìn)行，臺面用75%乙醇消毒，紫外照射30分鐘；
操作人員穿戴無菌手套、口罩，避免交叉污染。
T細(xì)胞激活試劑盒的操作流程
（一）激活體系配制
抗體包被步驟：
用PBS稀釋CD3抗體至5μg/ml，每孔加入50μl，4℃包被過夜或37℃孵育2小時；
棄去包被液，用PBS洗滌3次，去除未結(jié)合抗體（每次洗滌后離心5分鐘，200g）。
細(xì)胞重懸與刺激：
將T細(xì)胞調(diào)整至1×10?cells/ml，加入含10%FBS的RPMI1640培養(yǎng)基；
每孔加入100μl細(xì)胞懸液，再添加CD28抗體（終濃度1μg/ml）及IL-2（50U/ml），37℃培養(yǎng)。
（二）培養(yǎng)與監(jiān)測
培養(yǎng)條件控制：
每24小時觀察細(xì)胞形態(tài)（正常激活細(xì)胞呈圓形或短梭形，聚集成簇）；
每3天半量換液（棄去50%上清，補(bǔ)充新鮮培養(yǎng)基），維持IL-2濃度。
活性與增殖檢測：
MTT法：培養(yǎng)第5天每孔加入20μlMTT溶液（5mg/ml），4小時后溶解甲瓚，測定OD???值；
流式細(xì)胞術(shù)：標(biāo)記CD25、CD69等激活標(biāo)志物，評估激活效率（目標(biāo)激活率≥80%）。
（三）終止培養(yǎng)與下游應(yīng)用
細(xì)胞收獲：
離心收集細(xì)胞（300g，5分鐘），用PBS洗滌2次，去除殘留抗體；
用于CAR-T制備時，需確保細(xì)胞活率≥90%，細(xì)胞濃度1×10?cells/ml。
數(shù)據(jù)記錄：
記錄細(xì)胞形態(tài)、增殖曲線、激活標(biāo)志物表達(dá)等數(shù)據(jù)，繪制趨勢圖；
異常結(jié)果（如激活率＜60%）需分析原因（如抗體濃度不足、污染等）。
更新時間：2025-07-01
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