溫度范圍

T4 DNA聚合酶需在-20℃至-15℃的低溫條件下保存，部分產(chǎn)品在-20℃環(huán)境下可穩(wěn)定保存2-3年。儲存液成分通常包含磷酸鉀緩沖液、EDTA、DTT及甘油，以維持酶活性并防止反復(fù)凍融導(dǎo)致的降解。

操作規(guī)范

避免反復(fù)凍融：建議分裝后保存，每次取用僅解凍所需量。

運輸與臨時存放：若需短期運輸或臨時存放，可使用干冰或-80℃超低溫冰箱，并盡量縮短暴露于室溫的時間。

二、熱失活參數(shù)

標(biāo)準(zhǔn)失活條件

T4 DNA聚合酶可通過75℃加熱10-20分鐘實現(xiàn)失活。

應(yīng)用場景

終止反應(yīng)：在DNA平末端制備或標(biāo)記反應(yīng)后，需通過熱失活終止酶活性，防止過度消化。

兼容性：失活后的酶不會干擾下游實驗，但需確保失活條件不破壞DNA模板或產(chǎn)物。

三、反應(yīng)體系優(yōu)化

核心反應(yīng)條件

溫度與時間：

平末端制備：12℃反應(yīng)15分鐘，利用3'→5'外切酶活性修飾DNA末端。

高保真合成：37℃反應(yīng)5分鐘，按終濃度1 U/μl加入酶，確保高效摻入脫氧核糖核苷酸。

熱調(diào)節(jié)SLIC克隆：針對短同源片段，50℃處理30秒可提高克隆效率，通過高溫破壞DNA二級結(jié)構(gòu)，增強酶與模板的結(jié)合。

緩沖液組成：

隨酶提供的10×反應(yīng)緩沖液可優(yōu)化酶活性。需避免緩沖液污染或ATP降解，必要時補充新鮮ATP。

酶用量調(diào)整

標(biāo)準(zhǔn)用量：1μL 10×緩沖液+1μL T4 DNA聚合酶用于1μg DNA的10μL反應(yīng)體系。

靈活調(diào)整：

NGS文庫構(gòu)建：按終濃度1 U/μl加入酶。

低效率反應(yīng)：可適當(dāng)增加酶量，但需避免過量導(dǎo)致非特異性結(jié)合或產(chǎn)物降解。

DNA底物質(zhì)量

純度要求：通過瓊脂糖凝膠電泳或磁珠法純化DNA，去除蛋白質(zhì)、RNA等雜質(zhì)，防止抑制酶活性。

末端狀態(tài)：

平末端：加入5%-10%PEG-8000提高局部DNA濃度，增強連接效率。

粘性末端：確保末端未被核酸外切酶降解，制備后盡快反應(yīng)或-20℃保存。若懷疑損傷，可用Klenow片段補平。

pH與離子強度

最適pH：7.5-7.8，需定期檢查緩沖液pH值，必要時用酸或堿微調(diào)。

Mg²?濃度：緩沖液中通常含100 mM MgCl?，過高或過低均會影響酶活性，需嚴格按說明書配制。

反應(yīng)體積與操作細節(jié)

體積優(yōu)化：推薦10-20μL反應(yīng)體系，避免體積過小導(dǎo)致成分不均。

操作規(guī)范：使用精密移液器，避免氣泡產(chǎn)生；酶切質(zhì)粒與目的片段摩爾比建議為1:3或1:4，減少假陽性。