在生物制藥領(lǐng)域，桿狀病毒-昆蟲(chóng)細(xì)胞表達(dá)系統(tǒng)以其高效表達(dá)復(fù)雜蛋白的能力被廣泛應(yīng)用，尤其適用于疫苗、病毒樣顆粒和某些重組蛋白的生產(chǎn)。然而，該系統(tǒng)的產(chǎn)品質(zhì)量控制尤為復(fù)雜，主要涉及翻譯后修飾的異質(zhì)性、宿主來(lái)源雜質(zhì)以及病毒安全性等多個(gè)維度。產(chǎn)品質(zhì)量屬性的有效控制不僅直接影響藥物的安全性與有效性，也是監(jiān)管申報(bào)和技術(shù)審評(píng)的核心關(guān)注點(diǎn)。本文將從糖基化修飾差異的精準(zhǔn)檢測(cè)、宿主細(xì)胞蛋白殘留的多策略控制，以及病毒滅活與去除工藝的系統(tǒng)驗(yàn)證三個(gè)關(guān)鍵環(huán)節(jié)，深入解析其質(zhì)量控制策略，以期為工藝開(kāi)發(fā)與質(zhì)量研究提供系統(tǒng)參考。

一、如何精準(zhǔn)解析桿狀病毒表達(dá)產(chǎn)物的糖基化修飾差異？

桿狀病毒-昆蟲(chóng)細(xì)胞系統(tǒng)雖可完成基本的N-糖基化過(guò)程，但其糖型結(jié)構(gòu)通常以高甘露糖型為主，缺乏復(fù)雜型糖鏈和末端唾液酸化，這與哺乳動(dòng)物細(xì)胞表達(dá)系統(tǒng)存在顯著差異。這種差異可能影響蛋白藥物的藥代動(dòng)力學(xué)、免疫原性和生物學(xué)功能。因此，糖基化異質(zhì)性的精細(xì)解析成為該表達(dá)系統(tǒng)質(zhì)量控制的首要任務(wù)。目前，基于高分辨質(zhì)譜的技術(shù)策略已被廣泛采用，其關(guān)鍵步驟包括：

1.樣品前處理與糖鏈釋放：

通過(guò)酶切（如PNGase F）釋放N-糖鏈，并利用固相萃取法進(jìn)行純化，以去除肽段和鹽類(lèi)干擾。為提高質(zhì)譜檢測(cè)靈敏度，常對(duì)糖鏈進(jìn)行熒光標(biāo)記衍生化（如2-AB標(biāo)記）。

2.質(zhì)譜分析策略：

MALDI-TOF MS：適用于糖鏈的快速篩查和分子量分布分析，可初步判斷主要糖型類(lèi)別及其相對(duì)豐度。

LC-ESI-MS/MS：結(jié)合液相色譜的分離能力與串聯(lián)質(zhì)譜的結(jié)構(gòu)解析能力，可深入分析糖鏈分支模式、糖基組成及修飾狀態(tài)（如磷酸化、唾液酸化缺失等），提供更精細(xì)的糖型定性及相對(duì)定量信息。

3.數(shù)據(jù)解析與生物意義評(píng)估：

利用專(zhuān)業(yè)數(shù)據(jù)庫(kù)（如GlyConnect、UniCarb-DB）和軟件工具（如Byonic、GlycoWorkbench）進(jìn)行糖型鑒定與半定量分析。需特別關(guān)注關(guān)鍵質(zhì)量屬性，如高甘露糖型占比、末端半乳糖水平及是否存在免疫原性相關(guān)糖表位（如α-1,3-半乳糖）。結(jié)合功能實(shí)驗(yàn)（如受體結(jié)合、血清穩(wěn)定性）評(píng)估糖基化模式對(duì)藥物效力和安全性的潛在影響。

實(shí)際案例表明，某單抗藥物在昆蟲(chóng)細(xì)胞中表達(dá)時(shí)因糖基化簡(jiǎn)單化導(dǎo)致體內(nèi)半衰期顯著縮短，后續(xù)通過(guò)共表達(dá)哺乳動(dòng)物來(lái)源的糖基轉(zhuǎn)移酶優(yōu)化糖型結(jié)構(gòu)，最終改善藥代動(dòng)力學(xué)特性。

二、如何有效控制宿主細(xì)胞蛋白殘留？

宿主細(xì)胞蛋白（HCP）是生產(chǎn)工藝中引入的一類(lèi)重要雜質(zhì)，即便在低濃度下仍可能誘發(fā)免疫反應(yīng)或影響產(chǎn)品穩(wěn)定性，因此其殘留控制至關(guān)重要。由于桿狀病毒-昆蟲(chóng)細(xì)胞系統(tǒng)的宿主蛋白組成與哺乳細(xì)胞差異顯著，常規(guī)檢測(cè)工具可能不適用，需建立覆蓋廣、靈敏度高的多技術(shù)聯(lián)用策略：

1.ELISA 檢測(cè)技術(shù)：

早期工藝開(kāi)發(fā)中可采用市售通用型HCP檢測(cè)試劑盒（如針對(duì)Sf9或High Five細(xì)胞），其定量限可達(dá)1–2 ng/mL，適用于快速篩查和批次放行。然而，由于抗體交叉反應(yīng)性的限制，通用試劑盒可能無(wú)法識(shí)別所有HCP，尤其在工藝變更后可能出現(xiàn)新雜質(zhì)。

2.LC-MS/MS 補(bǔ)充分析：

非標(biāo)記定量蛋白質(zhì)組學(xué)（Label-free Quantification）：能夠無(wú)偏倚地鑒定和定量樣品中數(shù)千種蛋白質(zhì)，尤其適合低豐度HCP（檢出限可達(dá)ppm級(jí)別）的檢測(cè)，并可建立工藝特異性HSP譜庫(kù)。

多反應(yīng)監(jiān)測(cè)（MRM）：針對(duì)已知高風(fēng)險(xiǎn)HCP（如蛋白酶、核酸酶或糖苷酶）設(shè)計(jì)靶向檢測(cè)方法，實(shí)現(xiàn)高靈敏度和重復(fù)性的定量監(jiān)控。

3.整合控制策略：

建議在工藝開(kāi)發(fā)階段采用LC-MS/MS進(jìn)行全面雜質(zhì)譜分析，確定主要HCP種類(lèi)及其動(dòng)態(tài)變化；在產(chǎn)業(yè)化階段則建立產(chǎn)品特異性ELISA方法用于常規(guī)質(zhì)控。值得注意的是，純化工藝的優(yōu)化（如層析條件調(diào)整）可能導(dǎo)致HCP種類(lèi)和水平發(fā)生顯著變化（某些情況下可升高10–20倍），因此需持續(xù)監(jiān)測(cè)并與工藝性能關(guān)聯(lián)分析。

三、如何科學(xué)驗(yàn)證病毒安全性與工藝清除能力？

盡管桿狀病毒本身僅感染無(wú)脊椎動(dòng)物，不存在人類(lèi)致病風(fēng)險(xiǎn)，但生產(chǎn)過(guò)程可能引入外源病毒污染（如支原體、其他昆蟲(chóng)病毒等）。因此，必須對(duì)下游純化工藝的病毒清除能力進(jìn)行嚴(yán)格驗(yàn)證，以確保最終產(chǎn)品的生物安全性：

1.病毒指示劑的選擇：

根據(jù)ICH、FDA及EP相關(guān)指南，應(yīng)選擇具有不同物理化學(xué)特性的模型病毒，通常包括小型非包膜病毒（如鼠細(xì)小病毒MVM）、包膜病毒（如逆轉(zhuǎn)錄病毒X-MuLV）以及更大尺寸的DNA病毒（如腺病毒）。其目的是全面評(píng)估各類(lèi)工藝步驟對(duì)不同病毒的去污效果。

2.關(guān)鍵單元操作的驗(yàn)證要點(diǎn)：

層析工藝：如陰離子交換層析、親和層析等，需評(píng)估其病毒清除機(jī)制（如吸附去除、尺寸排阻），并驗(yàn)證在不同填料、載量及洗脫條件下對(duì)模型病毒的清除率（一般要求≥4 log）。

病毒滅活步驟：包括低pH孵育、溶劑/去污劑（S/D）處理、加熱滅活等，需明確關(guān)鍵工藝參數(shù)（如pH值、溫度、時(shí)間）的操作范圍，并證明其能夠穩(wěn)定、重復(fù)地降低病毒滴度。

3.風(fēng)險(xiǎn)評(píng)估與持續(xù)控制：

若某些工藝步驟經(jīng)充分驗(yàn)證可穩(wěn)定達(dá)到較高病毒清除率（如≥4 log），則可在后續(xù)常規(guī)生產(chǎn)中豁免該病毒的檢測(cè)。對(duì)于無(wú)法充分清除的潛在污染物（如內(nèi)源性逆轉(zhuǎn)錄病毒樣顆粒），需計(jì)算累積清除指數(shù)（LRV），并結(jié)合源頭控制（如細(xì)胞庫(kù)檢定）及多步清除策略，使最終風(fēng)險(xiǎn)低于可接受限度。

成功案例如某創(chuàng)新單抗藥物，通過(guò)驗(yàn)證陰離子交換層析可有效去除>4 log的X-MuLV病毒，不僅確認(rèn)了該步驟的核心純化地位，也為上市申報(bào)提供了關(guān)鍵安全性數(shù)據(jù)。

結(jié)論與展望

桿狀病毒-昆蟲(chóng)細(xì)胞表達(dá)系統(tǒng)在生物制藥中具有價(jià)值，但其產(chǎn)品質(zhì)量控制是一項(xiàng)多維度、跨學(xué)科的系統(tǒng)性工程：糖基化修飾需借助高分辨質(zhì)譜進(jìn)行“精細(xì)解碼"，宿主蛋白殘留需依靠ELISA與LC-MS/MS“協(xié)同作戰(zhàn)"，而病毒安全則須經(jīng)過(guò)“層層驗(yàn)證"以確保持續(xù)合規(guī)。未來(lái)，隨著質(zhì)譜多組學(xué)、高通量測(cè)序和數(shù)字化工藝建模技術(shù)的發(fā)展，產(chǎn)品質(zhì)量屬性的分析將朝著更高精度、更高通量和更實(shí)時(shí)化的方向演進(jìn)，從而進(jìn)一步推動(dòng)這一表達(dá)系統(tǒng)在復(fù)雜生物藥開(kāi)發(fā)中的應(yīng)用。

產(chǎn)品信息

杭州斯達(dá)特 志在為全球生命科學(xué)行業(yè)提供優(yōu)質(zhì)的抗體、蛋白、試劑盒等產(chǎn)品及研發(fā)服務(wù)。依托多個(gè)開(kāi)發(fā)平臺(tái)：重組兔單抗、重組鼠單抗、快速鼠單抗、重組蛋白開(kāi)發(fā)平臺(tái)（E.coli,CHO,HEK293,InsectCells）,已正式通過(guò)歐盟98/79/EC認(rèn)證、ISO9001認(rèn)證、ISO13485。

如何全面控制桿狀病毒-昆蟲(chóng)細(xì)胞表達(dá)系統(tǒng)的產(chǎn)品質(zhì)量？