你的磷酸化抗體，可能正在毀掉實(shí)驗(yàn)？

蛋白磷酸化作為信號(hào)通路研究的 "黃金指標(biāo)"，其檢測堪稱科研人必修的 "顯微鏡級" 技術(shù)活。Western blot 雖為常規(guī)手段，但磷酸化檢測的特殊性，讓每個(gè)環(huán)節(jié)都藏著 "翻車風(fēng)險(xiǎn)"。今天就來拆解這套 "高難度動(dòng)作" 的正確打開方式 ——

一、解碼樣品：先摸清磷酸化蛋白的 "脾氣"

磷酸化蛋白往往是細(xì)胞里的 "特殊玩家"，想讓它們 "現(xiàn)身" 得用點(diǎn)巧勁：

刺激誘導(dǎo)有講究：物理 / 化學(xué)刺激是激活磷酸化的常用手段，但時(shí)間和強(qiáng)度堪稱 "玄學(xué)"—— 查文獻(xiàn) + 預(yù)實(shí)驗(yàn)是捷徑（比如某細(xì)胞因子可能需 37℃刺激 15 分鐘才觸發(fā)磷酸化）。

數(shù)據(jù)庫助攻：PhosphoSitePlus 堪稱 "磷酸化百科全書"，輸入蛋白名稱即可解鎖其磷酸化位點(diǎn)、修飾頻率等 "隱藏信息"。

對照雙保險(xiǎn)：陽性對照（已知磷酸化樣本）和陰性對照（未刺激樣本）必須配齊，否則抗體認(rèn)沒認(rèn)錯(cuò) "目標(biāo)" 都難說！

二、蛋白提取：與時(shí)間賽跑的 "冰上芭蕾"

核心法則：快準(zhǔn)冷 + 抑制劑護(hù)體

制樣速度決定成?。?/span>

細(xì)胞洗滌用 4℃預(yù)冷 PBS，組織研磨請搬出液氮 "速凍"，全程讓樣品待在 "冰爽世界"，防止磷酸化 "轉(zhuǎn)瞬即逝"。

抑制劑是 "守護(hù)神"：

裂解液必須現(xiàn)配現(xiàn)用，蛋白酶抑制劑 + 磷酸酶抑制劑是 "基礎(chǔ)套餐"；若檢測酪氨酸磷酸化，1μmol/L 原釩酸鈉是 "隱藏菜單"。

劃重點(diǎn)：部分磷酸化抗體明確禁止煮沸變性（會(huì)破壞磷酸化位點(diǎn)），上樣前務(wù)必細(xì)讀抗體說明書！

保存細(xì)節(jié)控：提取后的蛋白盡快分裝成小份，-80℃凍存，反復(fù)凍融 = 讓磷酸基團(tuán) "離家出走"。

三、內(nèi)參雙殺：破解磷酸化數(shù)據(jù)的 "密碼本"

為什么別人的結(jié)果能發(fā)高分刊？可能贏在了內(nèi)參設(shè)計(jì)：

總蛋白內(nèi)參：比如檢測 p-Akt，必須同時(shí)跑 Akt 總蛋白 —— 磷酸化 / 總蛋白的比值變化，才是真正的 "磷酸化水平證據(jù)"。

體系內(nèi)參：Actin 或 GAPDH 是 "重量監(jiān)督員"，確保每孔上樣量一致，不然條帶深淺可能只是 "上樣誤差的障眼法"。

四、WB 操作：磷酸化條帶 "顯影秘籍"

1. 上樣與抗體的 "劑量博弈"

磷酸化蛋白含量低？每孔可加到 30-50μg 蛋白（普通 WB 約 20μg），給抗體更多 "捕捉目標(biāo)" 的機(jī)會(huì)。

抗體選優(yōu)選斯達(dá)特：斯達(dá)特專有兔單B細(xì)胞抗體開發(fā)平臺(tái)，重組兔單抗，特意性高，靈敏度高，穩(wěn)定性強(qiáng)，批間一致性好，是您WB 選擇。

2. 封閉與孵育的 "溫度哲學(xué)"

封閉液選 5% BSA（TBST 配制），奶粉可能藏著磷酸酶 "內(nèi)鬼"；封閉 1 小時(shí)剛剛好，太久會(huì) "遮住" 抗原表位。

4℃孵育過夜是 "黃金操作"：低溫讓蛋白穩(wěn)穩(wěn) "粘" 在膜上，避免高溫導(dǎo)致的抗原脫落（PVDF 膜的物理吸附特性了解一下）。

3. 洗膜的 "溫柔藝術(shù)"

搖床轉(zhuǎn)速別太猛，洗滌時(shí)間別太長 —— 磷酸化蛋白本就 "脆弱"，過度沖洗會(huì)讓它們 "離家出走"。

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磷酸化蛋白檢測避坑全指南：從樣品到 WB 的硬核操作手冊